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WinnGiorgio Santoni, Consuelo Amantini, … Maria Beatrice MorelliLéo Aubert, Neethi Nandagopal, … Philippe P. RouxSudjit Luanpitpong, Napachai Rodboon, … Surapol IssaragrisilNature Genetics Band 54, Seiten 1827–1838 (2022) Zitieren Sie diesen ArtikelWir identifizieren das nicht-selektive Protein des Natriumleckkanals (NALCN) als Schlüsselregulator der Krebsmetastasierung und der Ausbreitung nichtmaligner Zellen.Unter 10.022 menschlichen Krebsarten waren NALCN-Funktionsverlustmutationen bei Magen- und Darmkrebs angereichert.Die Deletion von Nalcn aus Adenokarzinomen des Magens, Darms oder der Bauchspeicheldrüse bei Mäusen veränderte die Tumorinzidenz nicht, erhöhte jedoch deutlich die Anzahl zirkulierender Tumorzellen (CTCs) und Metastasen.Die Behandlung dieser Mäuse mit Gadolinium – einem NALCN-Kanalblocker – erhöhte CTCs und Metastasen in ähnlicher Weise.Die Deletion von Nalcn aus Mäusen, denen onkogene Mutationen fehlten und die nie Krebs entwickelten, verursachte eine Ausscheidung von Epithelzellen ins Blut in einer Menge, die der bei tumortragenden Tieren entspricht.Diese Zellen wanderten zu entfernten Organen, um normale Strukturen zu bilden, einschließlich Lungenepithel und Nierenglomeruli und -kanälchen.Somit reguliert NALCN die Zellablösung aus festen Geweben unabhängig von Krebs, trennt diesen Prozess von der Tumorentstehung und entlarvt ein potenzielles neues Ziel für antimetastatische Therapien.Die meisten Krebspatienten sterben an den Folgen von Metastasen1, dem Prozess, bei dem sich Krebszellen vom Primärtumor auf andere Organe im Körper ausbreiten2.Das Blockieren der Metastasierung könnte das Überleben von Krebspatienten deutlich verbessern, aber wie dieser Prozess innerhalb der komplexen Kaskade der Tumorentstehung ausgelöst wird, bleibt unklar3.Da angenommen wird, dass die Metastasierung ein völlig abnormaler Prozess ist, der auf bösartige Gewebe beschränkt ist, hat sich die Aufmerksamkeit darauf konzentriert, genetische Mutationen als Treiber der Krebsmetastasierung zu identifizieren.Obwohl diese Forschung Gene entlarvt hat, die die Metastasierung in Mausmodellen und Menschen fördern, einschließlich einer Vielzahl von Ionenkanälen, die einen metastasenähnlichen Phänotyp induzieren, indem sie die Transmembranspannung verändern, um Änderungen in der Gentranskription zu induzieren4,5,6, bisher keine wiederkehrenden Metastasen. spezifische Mutationen wurden identifiziert2,3,7.Andere Zellfunktionen, die an der Metastasenkaskade beteiligt sind, umfassen „stammzellähnliche“ Multipotenz und Plastizität.Stammzellkapazität wurde metastatischen Krebszellen aufgrund ihrer Fähigkeit zugeschrieben, heterogene bösartige Zellpopulationen als metastatische Tumore zu rekonstituieren8,9.Der epitheliale mesenchymale Übergang (EMT)2 – eine Art zellulärer Plastizität, die sich während der normalen Gastrulation und Gewebeheilung zeigt – ist ebenfalls ein etabliertes Merkmal der Metastasenkaskade2,10.Unklar bleibt, wie Krebs diese normalen Zellfunktionen „entführt“, um eine Metastasierung zu ermöglichen.Hier identifizieren wir einen einzelnen Ionenkanal, NALCN, als Schlüsselregulator des Transports von Epithelzellen zu entfernten Geweben.NALCN ist für die Hintergrund-Natrium-Leckleitfähigkeit verantwortlich, die das Ruhemembranpotential aufrechterhält.Es reguliert Schlüsselfunktionen in erregbaren Geweben, zum Beispiel Atmung und zirkadiane Rhythmen11,12,13, und Gain-of-Function-Mutationen im Gen werden mit neurologischen Störungen in Verbindung gebracht14.Über die Rolle von NALCN in nicht erregbaren Geweben ist jedoch wenig bekannt.Wir zeigen, dass NALCN die Freisetzung bösartiger und normaler Epithelzellen in das Blut und ihren Transport zu entfernten Stellen reguliert, wo sie metastatischen Krebs bzw. scheinbar normales Gewebe bilden.Wir zeigen damit, dass die Metastasenkaskade unabhängig von der Tumorentstehung ausgelöst und betrieben werden kann.Diese Beobachtungen haben tiefgreifende Auswirkungen auf das Verständnis des Transports von Epithelzellen bei Gesundheit und Krankheit und identifizieren ein neues Ziel für antimetastatische Therapien.Wir haben zuvor gezeigt, dass Prominin1 (PROM1) basale Stammzellen in Antrumdrüsen des Magens markiert und dass ihre Abstammung Adenokarzinome in Prom1CreERT2/LacZ;KrasG12D;Trp53Flx/Flx (P1KP)-Mäusen bildet15.PROM1+, aber nicht PROM1−, Zellen, die aus P1KP-Adenokarzinomen des Magens (P1KP-GAC) isoliert wurden, vermehrten diese Tumore als Allotransplantate, was darauf hindeutet, dass PROM1+ P1KP-GAC-Zellen die bösartigen Gegenstücke der basalen Stammzellen der Antrumdrüse sind (Erweiterte Daten Abb. 1).Um zu verstehen, wie basale Stammzellen der Antrumdrüse während der Transformation beschädigt werden, haben wir ihre Transkriptome mit denen von PROM1+ P1KP-GAC-Zellen verglichen.Ionenkanäle und gelöste Träger wurden in PROM1+ P1KP-GAC-Zellen selektiv herunterreguliert (Abb. 1a und Ergänzungstabelle 1).Unter diesen war NALCN – ein Lecknatriumkanal, der zum Ruhezellmembranpotential und zur Zellerregbarkeit beiträgt13,16,17 – in seiner Expression auf PROM1+ Antrumdrüsen-Basalstammzellen beschränkt und in PROM1+ P1KP-GAC-Zellen herunterreguliert (Abb. 1b). .Unter 10.022 menschlichen Krebserkrankungen im Cancer Genome Atlas wurden nicht-synonyme Mutationen in NALCN bei Magen-, Darm-, Lungen-, Prostata- und Kopf- und Halskrebs angereichert (Abb. 1c)18,19.Diese Krebsarten enthielten auch Deletionen sowie Nonsense- und Frameshift-Mutationen mit einer Häufigkeit, die der in TP53 bei menschlichem Krebs beobachteten sehr ähnlich war20, was darauf hindeutet, dass NALCN ein Tumorsuppressor sein könnte (Ergänzungstabelle 2).a, Differentielle Genexpression zwischen normalen PROM1+-Magenzellen und P1KP-GAC-Zellen (herunterregulierte Ionenkanäle sind hervorgehoben).Benjamini-Hochberg korrigierter P-Wert, Alpha = 0,05.b, Nalcn-RNA-in-situ-Hybridisierung und Prom1-Expression (β-Galactosidase (LacZ)) im Prom1CreERT2/LacZ-Mausmagen (n = 3 biologische Replikate, jeweils 10 Felder; oben) und P1KP-GAC (n = 3 biologische Replikate, 10 Felder). jeweils; niedriger).Die Zahlen sind als Mittelwert ± Sem Prom1+/Nalcn+-Zellen gezeigt.Maßstabsleiste, 50 μm.c, t-SNE-Diagramm von 10.022 Krebserkrankungen beim Menschen (P-Wert, dN/dS gezeigt; Quelldaten).d, Mutantenreste, angereichert in NALCN-Porenrevolver (blau) und spannungsempfindlichen (rot) Domänen.P = 0,0275;permutierter P-Wert für die Wahrscheinlichkeit, zwei Cluster von 20 und 25 Resten zu beobachten.e, Einfluss von 196 NALCN-Mutationen auf den Selektivitätsfilterradius, bestimmt durch HOLE-Analyse.f, NALCN-Porenverschluss durch NALCN-Mutationen im Stadium I (n = 47), Stadium II (n = 73), Stadium III (n = 74) und Stadium IV (n = 27) menschlicher Krebsarten.Zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test: Stufe I versus II, P = 0,3488;Stufe I versus III, P = 0,1613;Stufe I versus IV, P = 0,0293.Balken bezeichnet den mittleren Filterradius.Um zu bestimmen, wie nicht-synonyme Mutationen die NALCN-Funktion bei Krebs beeinflussen könnten, verwendeten wir die HOLE-Analyse21, um ihre Auswirkungen auf den Porenradius des Ionenkanals von NALCN vorherzusagen, das in einem 575-Lipid 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- eingebettet und entspannt ist. Phosphocholin-Doppelschicht in Silico12,22,23.Dieses Modell sagte korrekt die Öffnung des NALCN-Kanals durch 22 Mutationen voraus, von denen bekannt ist, dass sie einen Funktionsgewinn verleihen12, und das Schließen des Kanals durch zwei Mutationen, die einen Funktionsverlust verursachen11 (Ergänzungstabelle 3).Nicht-synonyme, krebsassoziierte Mutationen waren innerhalb des Porenrevolvers und der spannungsempfindlichen Domänen gehäuft, die die Öffnung des NALCN-Kanals regulieren11,12: 75 % (n = 147/196) dieser Mutationen wurden vorhergesagt, um den Kanal zu schließen (Abb. 1d, e und Ergänzende Tabelle 4).Mutationen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie den größten Porenverschluss verursachen, wurden in den am weitesten fortgeschrittenen Krebsarten angereichert (Abb. 1f).Darüber hinaus haben menschliche GACs, in denen NALCN mutiert war, Gene hochreguliert, die mit EMT24, Metastasierung und Zellmigration assoziiert sind (Ergänzungstabellen 5 und 6).Als ersten Schritt, um zu testen, ob Nalcn das Fortschreiten von Krebs reguliert, veränderten wir seine Funktion in P1KP-GAC-Zellen mithilfe genetischer (Nalcn-kurze Haarnadel-RNA und NALCN-komplementäre DNA-Lentivirale Transduktion) oder chemischer (Gadoliniumchlorid; GdCl3)13 Ansätze.Die Ganzzellen-Voltage-Clamp-Analyse von P1KP-GAC-Zellen zeigte einen linearen GdCl3-empfindlichen Strom gegenüber Spannungsschritten im Bereich von ±80 mV, wie zuvor berichtet (Abb. 2a, b)13.Die Verringerung der NALCN-Expression in P1KP-GAC-Zellen eliminierte den NALCN-Strom, erhöhte die Zellproliferation und verlieh den orthotopen P1KP-GAC-Allotransplantaten eine EMT-Morphologie und ein Transkriptom (Abb. 2 und Ergänzungstabellen 7, 8).Umgekehrt erhöhte eine erhöhte Nalcn-Expression den GdCl3-empfindlichen Strom in P1KP-GAC-Zellen, verringerte die Zellproliferation und verlieh Allotransplantaten eine hyperepithelisierte Morphologie.a, Stromantworten auf Spannungsschritte von –80 bis 80 mV vor (oben) und nach (Mitte) Zugabe von 100 μM Gadolinium zu P1KP-GAC-Kontrolle, NALCNshRNA- und NALCNcDNA-transfizierten Zellen und Stromdichteantworten auf Spannungsschritte vor und nach Behandlung mit 100 μM Gadolinium (n = 5 biologisch replizierte Zellen; Werte sind Mittelwerte ± SEM).*P-Werte bei +40, +60 und +80 mV für Kontrollmagenzellen sind 0,039, 0,032 bzw. 0,023.P-Werte bei +40, +60 und +80 mV für NALCNcDNA-Zellen sind 0,013, 0,013 bzw. 0,003 (gepaarter t-Test).b, NALCN-vermittelte Voltage-Clamp-Ionenströme aus Kontroll-, NALCNshRNA- und NALCNcDNA-transfizierten P1KP-GAC-Zellen und NALCN-Leckstromdichte (Strom/Zellmembrankapazität, Mittelwert ± SEM) in Kontroll-, NALCNshRNA- oder NALCNcDNA-transfizierten Zellen (jeweils n = 5 Zellen, P-Werte, die den Spitzenstrom bei einem Spannungsschritt von +80 mV vergleichen, sind 0,05 Kontrolle gegenüber NALCNcDNA-Zellen und 0,023 Kontrolle gegenüber NALCNshRNA-Zellen; Holm-Sidak-Mehrfachvergleichsverfahren).c, Auswirkung der Gadoliniumbehandlung (10 µM, n = 386 Organoide; 100 µM, n = 264), NALCNSHRNA- (n = 611) oder NALCNcDNA- (n = 1.472) Transfektion auf die P1KP-GAC-Organoidgröße, normalisiert auf die durchschnittliche P1KP-GAC-Kontrolle behandelte Organoide (P1KP 0 µM, n = 663 Organoide, 4,274 ± 0,6238 (sem); P1KP-shRNA-Kontrolle n = 651 Organoide, 15,26 ± 2,406 (sem); P1KP-cDNA-Kontrolle n = 583 Organoide, 37,65 ± 5,872 (sem)).*** Exaktes P < 0,0001, zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test.d, Repräsentative makroskopische und photomikroskopische Bilder von Kontroll- (n = 27), NalcnshRNA- (n = 21) oder NALCNcDNA- (n = 22) transduzierten orthotopen P1KP-GAC-Allotransplantaten.Nalcn-RNA-Expression (in situ-Hybridisierung) und stromale (Vimentin) und epitheliale (CKAE1/AE3, CK7, CK5) Marker-Immunhistochemie sind gezeigt.Maßstabsbalken, 100 μm.e, Nalcn-mRNA-Transkripte pro Tumorzelle, aufgezeichnet in 20 einzelnen Tumorschnitten pro Behandlungstyp.Balken, Median.**P = 0,0024, ****P = 0,00006, zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test.Um zu untersuchen, wie sich der Funktionsverlust von Nalcn auf die Entstehung und das Fortschreiten von Krebs in intakten Geweben auswirkt, haben wir Mäuse erzeugt, die ein konditionales Nalcn-Allel beherbergen (NalcnFlx; Erweiterte Daten Abb. 2).Diese Mäuse wurden mit P1KP-, Villin1-CreERT2;KrasG12D;Trp53Flx/Flx (V1KP)- oder Pdx1-Cre;KrasG12D;Trp53Flx/+ (Pdx1KP)-Mäusen gezüchtet, um eine äquivalente Anzahl männlicher und weiblicher Mäuse zu produzieren, die entweder Nalcn-Wildtyp ( Nalcn+/+), Nalcn+/Flx oder NalcnFlx/Flx (insgesamt n = 551; Ergänzungstabelle 9).Alle Mäuse trugen das Allel Rosa26-ZsGreen (Rosa26ZSG) zur Linienverfolgung.Krebs in V1KP- und Pdx1KP-Mäusen ist durch die Cre-Expression auf den Darm25,26 bzw. die Bauchspeicheldrüse27,28 beschränkt.Prom1CreERT2/LacZ wird von einer Vielzahl von Stamm-/Vorläuferzellen exprimiert und induziert bei P1KP-Mäusen Tumore des Dünndarms, der Leber, der Lunge, der Speicheldrüsen, der Prostata, der Gebärmutter, der Haut und des Magens15,29.Da Gewebe eine altersabhängige Anfälligkeit für Transformationen aufweisen können15, aktivierten wir die Cre-Rekombination in P1KP- und V1KP-Mäusen mit Tamoxifen am 3. (P3) oder P60 postnatalen Tag.Wie erwartet entwickelten V1KP (n = 127/141) und Pdx1KP (n = 55/55) Mäuse Darm- bzw. Bauchspeicheldrüsentumoren, während P1KP-Mäuse Tumore im Magen (n = 49/269), Dünndarm (n = 59/269) und andere Standorte (n = 108/269)15,26,28;99 % (n = 212/214) der Tumore bei P1KP-Mäusen traten als einzelner Primärtumor auf (Abb. 3a – g und Ergänzungstabelle 9).Eine detaillierte makro- und mikroskopische Analyse von Tumoren ergab keinen signifikanten Einfluss des Alters der Induktion, des Geschlechts und/oder des Nalcn-Status auf die Tumorinzidenz, den Typ, das tumorfreie Überleben, die Tumorwachstumsrate, die Infiltration von Immunzellen, die Proliferation oder andere wichtige primäre Tumormerkmale ( Abb. 3, erweiterte Daten Abb. 3a–c und ergänzende Tabellen 9–11).Die Transkriptome von P1KP-GAC- und Pdx1KP-Pankreas-Adenokarzinomen (Pdx1KP-PACs) wurden jedoch mit Genen angereichert, die mit menschlichen CTCs und EMT assoziiert sind (Abb. 3j).a–c Tumore und repräsentative Mikrofotografien (H&E von allen Tumoren (links; Ergänzungstabelle 9) und duale Immunfluoreszenz von jeweils fünf unabhängigen Tumoren (rechts)) für Linienverfolgung (ZSG), epitheliale (CK7, CK20) und EMT-Marker (CDH2, CDH1) von P1KP-GAC (a), V1KP-IAC (b) und Pdx1KP-PAC (c).Maßstabsleiste, 50 μm.Einzelkanalbilder sind in der ergänzenden Abb. 1 dargestellt. d–g, oben: Organ-Heatmaps der Tumorinzidenz in P1KP bei P3 und V1KP bei Mäusen jedes Nalcn-Genotyps, rekombiniert bei P3 (d, e) oder P60 (f, g) .Unten: Überlebenskurven von Mäusen in jeder Kohorte.Das Verhältnis von Männchen zu Weibchen (M:F) ist gezeigt.P1KPP3, P = 0,6912;P1KP P60, P = 0,3897;V1KPP3, P = 0,1900;und V1KP P60, P = 0,8301.Mantel-Cox-Test.h, Organ-Primärtumor-Heatmaps und Überlebenskurven von Pdx1KP-Mäusen (P = 0,1095).Mantel-Cox-Test.Quelldaten für d–h sind in der Ergänzungstabelle 9 angegeben. i, Wachstumsraten von P1KP-GAC- (n = 38), V1KP-IAC- (n = 57) und Pdx1KP-PAC- (n = 28) Tumoren.Zweiseitige Mann-Whitney-U-Tests zeigten keinen signifikanten Unterschied in den Wachstumsraten zwischen Tumoren mit unterschiedlichen Nalcn-Genotypen P1KP-GAC: Nalcn+/+ (n = 11) versus Nalcn+/Flx (n = 18; p = 0,912), versus NalcnFlx /Flx (n = 9; P = 0,7103).V1KP-IAC: Nalcn+/+ (n = 16) versus Nalcn+/Flx (n = 25; P = 0,5169), versus NalcnFlx/Flx (n = 16; P = 0,7309).Pdx1KP-PAC: Nalcn+/+ (n = 10) versus Nalcn+/Flx (n = 13; P = 0,7844), versus NalcnFlx/Flx (n = 5; P = 0,1292).Balken, Median.Quelldaten sind in der Ergänzungstabelle 10 angegeben. j, Genset-Anreicherungsanalysen von Transkriptomen von Nalcn+/Flx- und NalcnFlx/Flx-P1KP-GAC-, V1KP-IAC- und Pdx1KP-PAC-im Vergleich zu Nalcn+/+-Tumoren.In Übereinstimmung mit diesen transkriptomischen Veränderungen erhöhte die Deletion von Nalcn die Krebsmetastasierung bei P1KP-, V1KP- und Pdx1KP-Mäusen dramatisch (Abb. 4a – d, Erweiterte Daten Abb. 4 und Ergänzungstabelle 12).Metastasierende und primäre Tumore wurden voneinander durch kombinierte histologische Überprüfung, Cosegregation von "übereinstimmenden" primären und sekundären Tumortranskriptomen durch unüberwachte hierarchische Clusterbildung und Anreicherung von histologisch vorhergesagten primären Tumorgensätzen innerhalb von metastatischen Tumortranskriptomen unterschieden (Abb. 4a, c und Erweiterte Daten Abb. 4).V1KP-Darm-Adenokarzinome (V1KP-IACs, n = 27 Mäuse) und Pdx1KP-PACs (n = 19 Mäuse) in Nalcn+/+-Mäusen erzeugten 2,82 ± 4,88 (Mittelwert ± SEM) bzw. 5,53 ± 4,02 Metastasen pro Maus (Abb. 4d und Ergänzungstabellen 9 und 12).Im krassen Gegensatz dazu stehen dieselben Tumoren in V1KP;Nalcn+/Flx (n = 51), V1KP;NalcnFlx/Flx (n = 26), Pdx1KP;Nalcn+/Flx (n = 23) und Pdx1KP;NalcnFlx/Flx (n = 13). ) Mäuse produzierten 16,82 ± 5,69 (zweischwänziger Mann-Whitney U-Test, P = 0,03 relativ zu Nalcn+/+), 26,04 ± 10,18 (P = 0,0009), 15,04 ± 3,62 (P = 0,007) und 13,46 ± 5,01 ( P = 0,02) Metastasen pro Maus.Die Nalcn-Deletion aus V1KP-IACs erhöhte die Metastasierung insbesondere in das Peritoneum, die Nieren und die Leber: Die Nalcn-Deletion aus Pdx1KP-PACs erhöhte die Metastasierung in das Peritoneum und die Lunge ( 4d ).Die Nalcn-Deletion erhöhte auch die Metastasierung von IAC und GAC in P1KP-Mäusen (n = 80) von 11,60 ± 3,45 Metastasen pro P1KP;Nalcn+/+-Maus auf 42,21 ± 11,23 Metastasen pro P1KP;Nalcn+/Flx-Maus und 40,24,0 ± 15,51 Metastasen pro P1KP ;NalcnFlx/Flx-Maus (Abb. 4d und Ergänzungstabellen 9 und 12).a, Unüberwachte hierarchische Clusterbildung von P1KP (GAC, n = 10; Lungenadenokarzinom, n = 6; Prostataadenokarzinom, n = 2), V1KP (IAC, n = 19), Pdx1KP (PAC, n = 13) und P1;PtenFlx /Flx;Trp53Flx/Flx (P1PtP) (hepatobiliär, n = 3; Lungenadenokarzinom, n = 1) Primärtumoren und Metastasen (Leber, n = 2; Bauchfell, n = 11; Niere, n = 1; Brusthöhle, n = 4; Lunge, n = 1; Lymphknoten, n = 2) Tumoren.Heatmap berichtet über die Anreicherung primärer Tumortranskriptome in metastasierenden Tumoren.b, beispielhafte metastatische ZSG+-Tumoren (getroffen, umrandet).Maßstabsleiste, 0,5 cm.c, Mikrofotografien (H&E (links) und Immunhistochemie/Fluoreszenz (rechts)) der Metastasen in b.Maßstabsleiste, 50 μm.Alle aufgezählten Metastasen wurden mit H&E ausgewertet (vollständige Liste ist in Ergänzungstabelle 9 angegeben; n = 7.076 Metastasen);n = 59 Metastasen wurden von ZSG für IHC ausgewertet und n = 20 Metastasen wurden durch Immunfluoreszenz ausgewertet.Einzelkanalbilder sind in der ergänzenden Abb. 1 dargestellt. d, Links: kumulative Gesamtzahl der Adenokarzinommetastasen pro Maus nach der Cre-Rekombination (zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test, Gesamttumorlast bei Nalcn-deletiertem versus Wildtyp Mäuse, Ergänzungstabelle 9).Rechts: Gesamtmetastasen pro Maus in anatomischen Regionen.Männliche/weibliche (M:F) und P3/P60-Mäuse sind gezeigt.V1KP IAC für einzelne Organe: Leber, *P = 0,0371 (NalcnFlx/Flx);Niere, *P = 0,0229 (NalcnFlx/Flx);und Peritoneum, *P = 0,0492 (Nalcn+/Flx) und **P = 0,0015 (NalcnFlx/Flx).Pdx1KP PAC einzelne Organe: Lunge, *P = 0,0328 (Nalcn+/Flx);und Peritoneum, **P = 0,0050 (Nalcn+/Flx).P1KP GAC und IAC einzelne Organe: Lunge, **P = 0,0085 (Nalcn+/Flx) und **P = 0,0048 (NalcnFlx/Flx).e, Metastatische Belastung und Organmetastasen in V1KP-IAC-Gadolinium- oder Kontroll-behandelten Mäusen.**P = 0,0090, zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test.Um den Funktionsverlust von Nalcn als Treiber von Krebsmetastasen weiter zu validieren, behandelten wir zusätzliche Kohorten von V1KP;Nalcn+/+ (n = 37), V1KP;Nalcn+/Flx (n = 17) und V1KP;NalcnFlx/Flx (n = 8) Mäuse mit GdCl3 (2 μg pro kg (Körpergewicht) pro Woche).IACs in GdCl3-behandelten V1KP;Nalcn+/+-Mäusen (n = 28) produzierten 18,32 ± 5,95 Metastasen pro Maus, verglichen mit nur 2,82 ± 4,88 bei Kontrollen (P = 0,02; Abb. 4e und Ergänzungstabelle 12).GdCl3 erhöhte jedoch weder bei V1KP;Nalcn+/Flx- noch bei V1KP;NalcnFlx/Flx-Mäusen die Metastasierung, was bestätigt, dass das Mittel insbesondere den metastatischen Phänotyp mit Nalcn-Deletion phänokopierte.Da die Nalcn-Deletion die Tumormetastasierung und die Expression von in menschlichen CTC-Transkriptomen angereicherten Genen durch GACs, IACs und PACs erhöhte (Abb. 3j), folgerten wir, dass Nalcn die Freisetzung von CTCs aus Primärtumoren regulieren könnte: CTCs werden von Tumoren in das Blut abgegeben als Vorläufer der Metastasierung30.Um dies zu testen, wurden kernhaltige GAC-, IAC- und PAC-Zellen, die durch Rekombination des Rosa26ZSG-Lineage-tracing-Allels im entsprechenden Epithel genetisch markiert worden waren, aus Vollblut isoliert und mittels ZsGreen (ZSG)-Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) quantifiziert ).Serielle, periphere Blutproben von Prom1CreERT2/LacZ (n = 397), Villin-1CreERT2 (n = 162) oder Pdx1Cre (n = 40) Mäusen, die das Rosa26ZSG-Allel und verschiedene Kombinationen von onkogenen und NalcnFlx-Allelen trugen, wurden analysiert (Ergänzungstabelle 13).Durchschnittlich (± sem) von 3,8 × 103 ± 0,9 × 103 zirkulierenden ZSG+-Zellen (CZCs) pro ml Blut (0,066 % ± 0,02 % Gesamtzellen) wurden von allen Mäusen nach durchschnittlich 254 ± 9,1 d nach der Cre-Rekombination isoliert (Abb. 5a – c und Ergänzungstabelle 13).Über alle drei Cre-Linien hinweg korrelierte die Anzahl der CZCs stark sowohl mit dem Vorhandensein eines Primärtumors (Abb. 5b) als auch mit der Gesamtzahl der Metastasen (multiple lineare Regression, T = 10,43, P = 0,000043; Ergänzungstabelle 13) , unabhängig vom Geschlecht der Maus oder dem Alter der Induktion.Eine Nalcn-Deletion oder eine GdCl3-Behandlung erhöhte signifikant den CZC-Spiegel in Tumor-tragenden P1KP-, V1KP- und Pdx1KP-Mäusen (Fig. 5c).Da weder Prom1CreERT2/LacZ, Villin-1CreERT2 noch Pdx1Cre hämatopoetische Zellen im Knochenmark rekombinieren (Abb. 5d), deuten diese Daten stark darauf hin, dass CZCs CTCs sind, die von Primärtumoren durch einen von NALCN regulierten Prozess abgegeben werden.In der unmittelbaren 5-Wochen-Periode nach der Tamoxifen-Rekombination wurden bei P1KP- und V1KP-Mäusen, die Nalcn+/+-, Nalcn+/Flx- oder NalcnFlx/Flx-Mäuse waren, ähnliche Mengen an zirkulierenden CZCs beobachtet, was darauf hindeutet, dass Nalcn die Zellausscheidung als spätes Ereignis reguliert (Abb. 5e,f und Ergänzungstabelle 13);Die Zeit, die für die Linienverfolgung benötigt wird, um bei unseren Mäusen einen stabilen Zustand zu erreichen, kann jedoch die CZC-Zahlen zu frühen Zeitpunkten unterschätzen.a, FACS-Profile, die CZCs in Blutproben von P1KP-Nalcn+/+- und NalcnFlx/Flx-Mäusen (Prozent kernhaltige Zellen) umschließen.Die Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abb. 2 dargestellt. b, Streudiagramm von CZCs (Prozent der gesamten kernhaltigen Blutzellen) von Prom1CreERT2/LacZ (n = 397), Villin-1CreERT2 (n = 162) oder Pdx1Cre (n = 40) Mäuse, die einen Primärtumor enthielten oder nicht.Daten sind biologisch unabhängige periphere Blutproben.Balken, Median.V1-Cre: *P = 0,0499, ****P < 0,0001;Pdx1-Cre: nicht signifikant (NS) P = 0,0513, **P = 0,0033;P1-Cre: **P = 0,0033, ****P < 0,0001;zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test.Quelldaten sind in Ergänzungstabelle 13 verfügbar. c, Streudiagramm von CZCs nach Genotyp und Gadoliniumbehandlung bei tumortragenden Tieren.Daten sind biologisch unabhängige periphere Blutproben.Balken, Median.P1KP (n = 112): *P = 0,02, NS P = 0,1204;V1KP (n = 64): **P = 0,0088, ***P = 0,0004, NS P = 0,4213;Pdx1KP (n = 34): *P = 0,0499, **P = 0,0027;zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test.Quelldaten sind in der Ergänzungstabelle 13 verfügbar. d, Repräsentative Mikrofotografien der ZSG-Immunhistochemie des Knochenmarks von Mäusen des angegebenen Genotyps mindestens 100 Tage nach der Cre-Rekombination.Skala, 100 μm.Drei Mäuse wurden für jeden Cre-Stamm bewertet.e,f, FACS-Quantifizierung von CZCs in P1KP (Nalcn+/+, n = 11; Nalcn+/Flx, n = 4; NalcnFlx/Flx, n = 6) (e) und V1KP (Nalcn+/+, n = 9; Nalcn+ /Flx, n = 4;NalcnFlx/Flx, n = 4) (f) Mäuse (Mittelwert ± SEM) von 1 Woche nach Tamoxifen-Induktion.Quelldaten sind in der Ergänzungstabelle 13 angegeben.Um den Ursprung von CZCs besser zu verstehen, haben wir Einzelzell-RNA-Sequenzprofile von CZCs erstellt, die aus Mäusen mit P1KP-GAC (n = 1.701 Zellen) oder V1KP-IAC (n = 119) sowie peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) isoliert wurden , n = 559; Abb. 6a) und verglich diese mit veröffentlichten Einzelzell-RNA-Sequenzprofilen von menschlichen Brust-, Lungen-, Pankreas- und Prostata-CTCs (n = 360) und PBMCs (n = 500)31,32,33,34 ,35,36.Menschliche CTCs umfassten drei überlappende Cluster (Erweiterte Daten Abb. 5a – c und Ergänzungstabellen 14 und 15): „huCTC1“ (angereichert mit Krebsmetastasen, EMT und epithelialen Gensätzen);huCTC3 (angereichert mit früh-erythroiden und EMT-Gensets);und huCTC2 (gemeinsame Profile von huCTC1 und huCTC3).huCTC1–3 exprimierte β-Globin (HBB) – einen Überlebensfaktor für menschliche CTCs33 – sowie HBA1, HBA2 und HBD.Maus-CZCs bildeten sieben Cluster, deren Transkriptome signifikant mit huCTC1 (mCZC2–7), huCTC2 (mCZC2, 3, 5–7) und huCTC3 (mCZC2–7) übereinstimmten und Orthologe von HBA1, HBA2 (Hba-a1, Hba-a2) enthielten. , HBB (Hbb-bs, Hbb-bt), ANXA2 und LGALS3 sowie Gene, die im normalen und malignen Magen und Dünndarm exprimiert werden (Abb. 6a, b, Erweiterte Daten Abb. 5c–g und Ergänzungstabellen 16 und 17) .Normalisierung und Uniform Manifold Approximation and Projections (UMAP) aller Einzelzell-RNA-Sequenzprofile zeigten auch eine signifikante Überlappung in Maus-CZC- und menschlichen CTC-Transkriptomen, insbesondere in denen, die mit CD71 + erythroiden Genen angereichert sind (erweiterte Daten, Abb. 5e–g und Ergänzungstabelle 18). .Koimmunfluoreszenz von peripheren Blutabstrichen von Mäusen mit V1KP-IAC und P1KP-GAC bestätigte die CZC-Expression von HBA-A1, LGALS3 und Epithelzellmarkern (KRT80, CDH1) und CDX2, die das Darmepithel markieren (Abb. 6c).PBMCs exprimierten diese Marker nicht, exprimierten jedoch Marker von PBMCs (z. B. CD45).a, UMAP von SCS-Profilen von CZCs (n = 1.820) und PBMCs (n = 559).b, Genset-Anreicherung von 2.086 Gensets in UMAP-Clustern in a.c, Coimmunfluoreszenz von CZCs und PBMCs in P1KP- (oben) und V1KP- (unten) Mäusen (ZSG; Maßstabsbalken, 10 μm).Repräsentative Mikrofotografien von 22 Zellen, die in n = 20 Blutausstrichen von n = 5 tumortragenden Tieren identifiziert wurden.d, Autofluoreszenz von Pdx1KP-PAC CZC-Metastasen in der ganzen Lunge einer immungeschwächten Empfängermaus (oben links; Maßstabsbalken, 0,5 cm).Andere Bilder zeigen H&E (repräsentatives Bild von 3.061 ausgewerteten Metastasen) oder Koimmunfluoreszenz von Metastasen (repräsentative Bilder von 28 ausgewerteten Metastasen) von P1KP-GAC- oder V1KP-IAC-CZC-Metastasen in Empfängermäusen (Maßstabsbalken, 50 μm).Einzelkanalbilder sind in der ergänzenden Abb. 1 dargestellt. e, Gesamtmetastasen pro Organ in Empfängermäusen, denen 25.000 CZCs injiziert wurden.P1KP Nalcn+/Flx PAC, n = 5 Mäuse;P1KP Nalcn+/+ GAC, n = 2 Mäuse;P1KP Nalcn+/Flx GAC, n = 3 Mäuse;V1KP Nalcn+/Flx IAC, n = 2 Mäuse;V1KP Nalcn+/+ + GdCl3 IAC, n = 5 Mäuse.Quelldaten sind in der Ergänzungstabelle 19 angegeben. f, Metastasenfreies Überleben von immundefizienten NOD-scid-Gamma-Empfängermäusen, denen unterschiedliche Zahlen (10.000, 1.000, 100 oder 10) von P1KP-GAC oder Pdx1KP-PAC-CZCs injiziert wurden (n = 3 Mäuse für jeden Zustand). ).***P = 0,0002 Mantel-Cox-Statistik.Quelldaten sind in der Ergänzungstabelle 19 verfügbar.Um direkt zu testen, ob CZCs metastatisches Potenzial besitzen, injizierten wir getrennte Aliquots von 25.000 CZCs, die aus Mäusen mit P1KP-PAC, P1KP-GAC oder V1KP-IAC isoliert wurden, in die Schwanzvenen von immungeschwächten Mäusen.Innerhalb von 75 Tagen entwickelten alle Mäuse zahlreiche ZSG+-Metastasen in Lunge, Leber, Nieren und/oder Bauchfell (Abb. 6d, e und Ergänzungstabelle 19).Ähnliche Studien mit zunehmenden Zellverdünnungen zeigten, dass nur zehn CZCs erforderlich waren, um Metastasen zu erzeugen (Abb. 6f und Ergänzungstabelle 19).Daher sind CZCs hochgradig angereichert mit CTCs, die das Transkriptom menschlicher CTCs rekapitulieren und durch einen von Nalcn regulierten Prozess in das periphere Blut abgegeben werden.Die Verhinderung der CTC-Ausscheidung in das periphere Blut könnte die Metastasierung stoppen, aber die Trennung dieses Prozesses von der komplexen Kaskade der Tumorentstehung hat sich als schwierig erwiesen.Deletion von Nalcn aus frisch isolierten Magenstammzellen P1;NalcnFlx/Flx, denen onkogene Allele, schnell hochregulierte Gene im Zusammenhang mit Invasion (z. B. Mmp7, Mmp9, Mmp10 und Mmp19) und Magen-EMT (z. B. Zeb1, Fstl1, Sparc, Sfrp4, Cdh6 und Timp3; Ergänzungstabellen 20 und 21), was darauf hindeutet, dass NALCN die Zellablösung aus festen Geweben unabhängig von der Transformation regulieren könnte.Um dies zu testen, suchten wir nach CZCs im peripheren Blut von Prom1CreERT2/LacZ;Rosa26ZSG;Nalcn+/+ (P1RNalcn+/+, n = 87), P1RNalcn+/Flx (n = 50) und P1RNalcnFlx/Flx (n = 37) Mäusen denen onkogene Allele fehlten und die nie Tumore entwickelten (Ergänzungstabelle 13).Bemerkenswerterweise erhöhte die Deletion von Nalcn die Anzahl der CZCs in diesen Mäusen auf Niveaus, die denen ähneln, die bei tumortragenden Tieren beobachtet wurden ( 5b , c und 7a ).Einzelzell-RNA-Sequenzierungsprofile (SCS) von CZCs, die aus Mäusen ohne Tumor (ntCZC) isoliert wurden, die mit CZCs von Tieren mit Tumoren (tCZC; Fig. 7b) co-geclustert wurden.Die große Mehrheit der tCZC- und ntCZC-SCS gruppierte sich nicht mit SCS-Profilen von primären IACs, GACs oder normalem Gewebe, sondern mit SCS-Profilen von Metastasen (Abb. 7b und Ergänzungstabelle 22).SCS-Profile sowohl von tCZCs als auch von ntCZCs stimmten mit denen menschlicher CTCs überein und exprimierten, ähnlich wie menschliche CTCs2, Gene, die mit Stamm- und Vorläuferzellen assoziiert sind;obwohl tCZCs relativ stärker für Metastasen- und Invasionsassoziierte Gensätze angereichert waren (Erweiterte Daten Fig. 6a und Ergänzungstabellen 23 und 24).Koimmunfluoreszenz von Blutausstrichen bestätigte, dass sowohl ntCZCs als auch tCZCs Marker von huCTCs gemeinsam haben, einschließlich HBA-A1 ( 6c und 7c ).a, ntCZCs identifiziert in einzelnen nicht tumortragenden P1RNalcn+/+ (n = 87), P1RNalcn+/Flx (n = 50) und P1RNalcnFlx/Flx (n = 37) Mäusen.Balken, Median.****P < 0,0001, zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test.Quelldaten sind in Ergänzungstabelle 13 verfügbar. b, UMAP von 201.183 SCS-Profilen von PBMCs, tCZCs und ntCZCs sowie Zellen, die aus den angegebenen normalen und malignen Mausgeweben stammen.c, Coimmunfluoreszenz von ntCZCs und PBMCs in peripheren Blutausstrichen von P1RNalcnFlx/Flx-Mäusen (ZSG; Maßstabsbalken, 10 μm).Repräsentative Mikrofotografien von 11 Zellen, die in n = 20 Blutausstrichen von n = 4 Mäusen identifiziert wurden.Einzelkanalbilder sind in der ergänzenden Abb. 1 dargestellt. d–f, direkte ZSG-Immunfluoreszenz-Mikrofotografien von ZSG+-Zellen in Lunge und Niere (Maßstab, 50 μm) (d) und in der Lunge gezählt (kein Cre, n = 2). Mäuse, 5 Lungenlappen; Nalcn+/+, n = 3 Mäuse, 9 Lungenlappen; Nalcn+/Flx, n = 3 Mäuse, 8 Lungenlappen; NalcnFlx/Flx, n = 5 Mäuse, 12 Lungenlappen; NS P = 0,1312, *P = 0,0168, zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test) (e) und Niere (kein Cre, n = 2 Mäuse, 4 Nierenschnitte; Nalcn+/+, n = 3 Mäuse, 11 Nierenschnitte; Nalcn+/Flx, n = 3 Mäuse, 10 Nierenschnitte, NalcnFlx/Flx, n = 5 Mäuse, 18 Nierenschnitte, ****P < 0,0001, zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test) (f).g, Organ-Heatmap der Gesamtzahl von ZSG+-Zellclustern pro Maus, identifiziert in Organen von Empfängermäusen, denen P1RNalcnFlx/Flx-ntCZCs injiziert wurden.h, Koimmunfluoreszenz von P1RNalcnFlx/Flx ntCZCs (Pfeile), eingebaut in die Nieren von Empfängermäusen (Pfeile zeigen ZSG+-Zellen an; Maßstabsbalken, 50 μm).Repräsentative Mikrofotografie von n = 5 ZSG-Resten, die in einem Gewebefeld von n = 5 Mäusen identifiziert wurden.Einzelkanalbilder sind in der ergänzenden Abb. 1 dargestellt. GLO, Glomerulus.i, Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop-Bild von P1RNalcnFlx/Flx-CZCs, die in die Nierenrinde von Empfängermäusen eingebaut wurden.Maßstabsbalken, 100 μm.Repräsentatives Bild von n = 2 untersuchten Mausnieren.Um das Schicksal von ntCZCs zu verstehen, suchten wir nach ZSG+-Zellen in den Lungen und Nieren von gealterten V1R- und Pdx1R-Nalcn+/+-, Nalcn+/Flx- und/oder NalcnFlx/Flx-Mäusen.Bemerkenswerterweise wurden ZSG+-Zellcluster in diesen Organen bei Nalcn-deletierten Tieren leicht nachgewiesen, waren jedoch bei Nalcn+/+-Mäusen nicht vorhanden oder wurden in signifikant geringeren Mengen nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass ntCZCs zu entfernten Organen verkehren und sich darin einbetten (Abb. 7d–f und erweiterte Daten Fig. 6b, c).Um dies direkter zu testen, injizierten wir getrennte Aliquots von 25.000 ntCZCs, die aus P1RNalcnFlx/Flx-Mäusen isoliert wurden, in die Schwanzvenen von sechs immungeschwächten Mäusen.Alle Empfängermäuse blieben nach durchschnittlich 100 Tagen klinisch gesund, enthielten jedoch zahlreiche ZSG+/Cdh1+/Icam1+-Spenderzellcluster in Lunge, Leber, Nieren und Peritoneum mit einer ähnlichen Häufigkeit wie metastatische Tumore, die durch Injektionen von tCZCs in die Schwanzvene gebildet wurden ( Abb. 6e, 7g–i und Erweiterte Daten Abb. 6d).Überführte ntCZCs bildeten offensichtlich normale Strukturen in Zielorganen, wobei das extremste Beispiel Nierenglomeruli und Tubuli waren (Abb. 7h, i).Somit reguliert NALCN die Zellausscheidung aus festen Geweben unabhängig von Krebs, trennt diesen Prozess von der Tumorentstehung und demaskiert einen Onkogen-unabhängigen Metastasierungsweg.Obwohl P1RNalcn+/Flx (n = 118) und P1RNalcnFlx/Flx (n = 112) Mäuse keinen Krebs entwickelten, ergab eine Ganzkörper-Autopsie dieser Mäuse eine schwere Nieren- und Hautfibrose im Vergleich zu P1RNalcn+/+ (n = 65) Mäusen (Ergänzung Tabelle 25 und Erweiterte Daten Abb. 7).Nat.Med.Vorderseite.Onk.Biophys.AuflösungNat.Nat.Med.Wissenschaft.Erw.Vorderseite.Nat.JährlichBiol.Nat.Rev. Clin.Onk.Zheng, Y. et al.Nat.Kommun.Mol.JährlichBin.Wissenschaft.Nat.Vorderseite.Onk.Nat.Biophys.Nat.Nat.Wissenschaft.Nat.Biotechnologie.J.Chem.Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenDie Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:Leider ist für diesen Artikel derzeit kein teilbarer Link verfügbar.Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt